Metodologías de identificación en hongos.

Los hongos están asociados a diversas causas de enfermedad, así como en interacciones biológicas y procesos bioquímicos, por lo cual su identificación es importante no solo en el campo de la salud, sino también en patologías de plantas, biodeterioro, aplicaciones biotecnológicas y en investigaciones ambientales. La mayor parte de las especies de hongos, fueron identificados y clasificados tomando en cuenta solo el enfoque morfológico (características fenotípicas), no obstante otros grupos fueron examinados desde diversos aspectos (fisiológicos, bioquímicos, composición de la pared celular y de proteínas, y técnicas moleculares) debido a su importancia económica y/o médica (Guarro y col., 1999; Balajee y col., 2009).

Nomenclatura de hongos

En la sistemática de organismos, por lo general cuando es descubierto un nuevo individuo debe ser descrito bajo los lineamientos aceptados a nivel internacional, el nombre se le asignará bajo el sistema binomial latinizado, propuesto por Carl von Linneo (S. XVII). Dicha sistematización en la clasificación de especies tiene el objetivo de establecer lineamientos con reglas claras y concretas, para evitar y rechazar nombres que causen confusión (Guarro y col., 1999).

La nomenclatura de los grupos biológicos está normada por diversos códigos, la cual depende del tipo de organismo (plantas, bacterias, virus y animales) para el caso de la taxonomía de hongos incluyendo las levaduras, se basa en los lineamientos de la ICBN (International Code of Botanical Nomenclature) (Greuter y col., 1994).

Los hongos se propagan de forma sexual (teleomorfos) y asexual (anamorfos) debido a esto se ha formado una nomenclatura dual para su identificación, la cual está aceptado por la ICBN. Holomorfo es un terminó reservado para aquellos hongos que presentan esporulación teleomórfica y anamórfica al mismo tiempo, un ejemplo de ellos son los zigomicetos. Así mismo es importante señalar que la descripción de los hongos se dio bajo circunstancias desconocidas hasta entonces de la existencia de sus fases sexuales (Gams, 1995; Guarro y col., 1999).

Identificación morfológica

La identificación y clasificación de los hongos a diferencia de otros microorganismos (bacterias y virus) se ha basado principalmente sobre criterios morfológicos. La microscopia de luz ha sido la herramienta más utilizada, con algunas mejoras como la fluorescencia, citoquímica y el desarrollo de nuevas técnicas de teñido para las estructuras apicales de las ascas (Guarro y col., 1999).

Por lo general los hongos cultivados en condiciones de laboratorio solo desarrollan las características de la fase asexual y en muy raras ocasiones las de la fase teleomorfa. Por lo cual la identificación de anamorfos se basa principalmente en el tipo de conidio y procesos de conidiogénesis (Hennebert y Sutton, 1994). Sin embargo varias características asociados a la fase teleomorfa son útiles para su identificación y clasificación, por ejemplo el tipo de cuerpo fructificante (basidiomas, ascomas) y el tipo de ascas (microscópicas y globosas) (Guarro y col., 1999).

Estudios en la pared celular de los hongos por microscopia electrónica de transmisión, han permitido diferenciar los ascomicetos de basidiomicetos. A menudo los detalles en la superficie de las ascosporas ha facilitado la identificación a nivel de especie en algunos ascomicetos (De Hoog y Guarro, 1995; Kurtzman y Fell, 1998).

La identificación de hongos, basado en el enfoque fenotípico siempre ha sido criticada por la falta de una terminología universal y objetiva, así mismo las características morfológicas están sujetas a la variación de las condiciones ambientales (Guarro y col., 1999). Además el sistema dual de clasificación (teleomorfos y anamorfos) basado en el enfoque fenotípico, no establece una coherente correlación entre las taxonomías de los ascomicetos y deuteromicetos (Hennebert y Sutton, 1994).

Técnicas bioquímicas de identificación de hongos

 Metabolitos secundarios

Los metabolitos secundarios son compuestos no esenciales, ni intermediarios clave en el metabolismo del individuo, sin embargo es posible que desempeñe otro rol en el desarrollo de los hongos. Por lo general se encuentran como una mezcla de moléculas de estructura química rara, los más comunes pueden ser esteroides, terpenos, alcaloides, ciclopéptidos y cumarinas, algunos de éstos compuestos son micotoxinas (Hawksworth y col.,1995).

Las mejoras en la cromatografía de capa fina ha permitido identificar de manera más rápida los metabolitos secundarios, que con las técnicas convencionales (extracción, purificación y concentración). El perfil de metabolitos secundarios, ha sido útil para la identificación y clasificación de líquenes, pero el método se ha empleado de forma reservada en la taxonomía de los Ascomycetes y Basidiomycetes, debido a que la producción de tales compuestos pueden estar influidos por las condiciones ambientales, así como por las dificultades que se presentan en la técnica (Carlile y Watkinson, 1994). Sin embargo, su potencial se ha demostrado en estudios realizados en los órdenes Eurotiales y Xylariales (phylum Ascomycota), las especies pueden ser identificadas sobre la base de sus perfiles de metabolitos (Frisvad, 1994; Whalley y Edwards, 1995).

Ubiquinonas

Además de los metabolitos secundarios, en taxonomía de hongos también se han utilizado otros compuestos que desempeñan un rol esencial en el metabolismo, como es el caso de las ubiquinonas (coenzima Q), éstos compuestos desempeñan un papel importante en la cadena del transporte de electrones del sistema respiratorio (Carlile y Watkinson, 1994). Se sabe que el número de isoprenos adheridas al núcleo de la quinona es variable, y tales diferencias se emplean para la clasificación (género y subgénero) en levaduras; sin embargo para las levaduras negras y hongos filamentosos el método se ha utilizado de forma limitada (Yaguchi y col., 1996) debido a que las conclusiones basadas solo en el sistema de ubiquinona son debatibles, así mismo dependiendo del método utilizado es posible obtener diferente conjuntos de datos (Samson, 1991).

 Composición de ácidos grasos

La composición de ácidos grasos celulares, se emplea rutinariamente en la taxonomía bacteriana. El tipo de ácido graso y su concentración relativa son las características que se utilizan para la separación de taxones, éstas técnicas raramente se empleaban en hongos, sin embargo algunos ácidos grasos son producidos por hongos y no por las bacterias (Veys y col., 1989). Estos análisis se utilizan cada vez más en la taxonomía de hongos (Stahl y Klug, 1996).

La cromatografía de gases, en combinación con los métodos de análisis multivariado, se ha empleado con éxito en estudios de ácidos grasos en hongos filamentosos, incluyendo Oomycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, además de mycelia sterilia. Sin embargo, los aspectos técnicos del procedimiento deben ser estandarizados y controlados para minimizar las fuentes de variación debido a que pueden influir en los resultados; entre los factores más importantes a ser normalizados son las condiciones de cultivo y la temperatura (Stahl y Klug, 1996).

 Composición de la pared celular

Estudios en la pared celular de los hongos, han demostrado diferencias en su estructura y composición, lo cual se ha utilizado para definir taxa superiores. La celulosa es un componente particular de la fracción alcalino-soluble en Oomycetes, por el contrario en Ascomycetesy Basidiomycetes contienen quitina y glucano en estas fracciones, y en Zygomycetes se presentan el quitosano y el ácido poliglucorónico. Así mismo variaciones significativas en la composición de azúcares de la pared celular se han observado en géneros de dermatofitos (Guarro y col., 1993). La presencia o ausencia y la diferencia en cantidad de algunos polisacáridos como la glucosa, manosa, fucosa, galactosa, ramnosa y xilosa son característica que se han empleado en la clasificación de hongos (Carlile y Watkinson, 1994).

 Composición proteica

Los patrones de isoenzimas (zimogramas) han permitido diferenciar especies y establecer relaciones generales (Murphy y col., 1990). La secuenciación de proteínas y los métodos inmunológicos también se utilizan para la caracterización interespecífica debido a su adecuada resolución (Kohn, 1992). El empleo de los zimogramas se considera una técnica económica y práctica para la detección de especies en grandes poblaciones; las aloenzimas (isoenzima alélica) son generalmente utilizadas en estudios filogenéticos (Kohn, 1992)

Técnicas moleculares-técnicas basadas en PCR

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) es una tecnología que consiste en amplificar in vitro fragmentos específicos de ADN, con la finalidad de detectar una secuencia o gen de interés en el genoma de un organismo. En 1985 Kary B. Mullis patentó y público su invención (PCR), desde la fecha se ha empleado con éxito en diferentes campos del conocimiento como en la medicina, biología, agronomía, áreas forense y taxonomía (Dale y von-Schantz, 2007).

La PCR consiste en tres pasos esenciales: 

a) Desnaturalización del ADN, sirve para separar por temperatura (94°C) el ADN de doble cadena a moléculas de cadena sencilla, que servirán de molde para la síntesis de los fragmentos.

 b) Alineamiento, la temperatura se reduce para permitir el reconocimiento de los oligonucleótidos a las cadenas moldes, la temperatura optima de alineamiento pude variar desde los 40 a 65 °C, y dependerá de las características de los oligonucleótidos (su longitud, composición de bases nitrogenadas y especificidad).

c) Extensión, el ADN polimerasa producirá la cadena de ADN complementaria a partir de los oligonucleótidos unidos a las cadenas moldes, la temperatura de extensión optima es aproximadamente a 72°C; la enzima ADN Taq polimerasa agrega aproximadamente 1000 bases por minuto. Estos pasos (ciclo) se repiten las veces que sea necesario, para obtener de manera exponencial el fragmento de interés (en 30 a 40 ciclos se acumula alrededor de 106 a 108 moléculas) a partir de la muestra de ADN (Dale y von-Schantz, 2007; Valdez y Kahl, 2005).

Los procesos de replicación de ADN tienen alta fidelidad, sin embargo el genoma de los hongos es dinámico, en la cual pueden ocurrir eventos de sustitución, inserción, deleción, transposición, rearreglos en regiones génicas o en cromosomas, movimiento de genes desde los orgánulos hacia el núcleo, así como la adquisición de elementos génicos de otros organismos. Por lo tanto el genoma de los hongos presenta varias regiones de ADN cuyas características pueden ser analizadas en cualquier especie fúngica, para lo cual se han desarrollado diversas técnicas (a menudo con desconcertante siglas) para estudiar la variación genética de los organismos incluyendo los hongos (Piercey-Normore y Egger, 2001).