Colecta, cultivo y preservación.

Colecta

Muestras de la Piel: se deben recoger abundantes escamas de la zona lesionada, preferiblemente de los bordes o bien pasar un trozo de moqueta especial y estéril varias veces por la lesión.

Muestras de la Cabeza: recoger las escamas, los pelos (con raíz) o pasar la moqueta.

Muestras de las Uñas: tomar fragmentos pequeños de las uñas, o un raspado subungueal. Si hay un exudado perungueal se recogerá la muestra con una torunda estéril.

Lesiones en pliegues (interdigitales, unguinales, submamarios, labiales,...): recoger escamas o pasar la moqueta. Si la lesión es exudativa y no se pueden recoger escamas, la muestra se tomará con una torunda o mediante pases de moqueta.                                                                                                               

Lesiones en mucosas oral, balanoprepucial, etc: se recogerá un exudado mediante una torunda. Se tomarán preferiblemente dos muestras, una para examen microscópico y otra para la siembra en un medio de cultivo.

Podemos colectar:

• Hongos macroscópicos
• Hongos microscópicos

Se pueden Aislar mediante:

• Transferencia  directa
• Dilución en placa
• Esterilización superficial
• Utilización de carnadas
• Cámaras  húmedas

Cultivo de microorganismos

• Proceso de inducir su crecimiento
• El cultivo in vitro necesita la preparación de sustancias que el hongo pueda utilizar como alimento: Medios de Cultivo.

Medios de cultivo

Para el aislamiento primario de los hongos, se utilizan diversos medios de cultivo. Estos medios hay que seleccionarlos en función del hongo que se sospeche y del tipo de muestra.

Los medios de cultivo se pueden utilizar en tubos cerrados con tapón de rosca o en placas de petri. La gran superficie de estas últimas facilita el aislamiento y la dilución de sustancias inhibitorias en las muestras. Es importante que el medio no se deseque por lo que el espesor de las mismas debe ser por lo menos de 25 mm, aproximadamente 35-40 mL de medio. Las placas se contaminan con facilidad durante la incubación por lo que es aconsejable sellarlas con cinta adhesiva. Los medios en tubo tienen la ventaja de que no se deshidratan y se contaminan menos, pero en cambio tienen menos superficie.

Si la muestra es de una zona contaminada se deben incluir medios que contengan Cloranfenicol y Cicloheximida. El primero inhibe los contaminantes bacterianos y el segundo inhibe el crecimiento de hongos saprofitos. Hay algunas especies patógenas que pueden ser inhibidas por ambos, por esta razón es importante usar medios con y sin agentes inhibidores. Las muestras de zonas estériles pueden inocularse en medios sin sustancias inhibitorias.

La temperatura de incubación debe ser seleccionada teniendo en cuenta el tipo de hongo, en general, los medios deben incubarse a 25ºC y a 37ºC durante 4 semanas antes de considerarse como negativos. Si se emplean tubos con tapón de rosca deben estar flojos para permitir la entrada de aire.

Medios más utilizados

·         Agar Dextrosado de Saboureaud con Cicloheximida y Cloranfenicol: se utiliza para el aislamiento e identificación de dermatófitos y Cándidas.

·         Agar Dextrosado con Cloranfenicol sin Cicloheximida: se utiliza para el aislamiento e identificación de patógenos ambientales y oportunitas.

·         Agar de harina de maíz (“Corn Meal Agar”):

o    Suplementado con Tween 80: para diferenciar distintas especies de Cándida y para realizar subcultivos ya que estimula la esporulación de hongos miceliales.

o    Suplementado con 10 gramos de Glucosa: para diferenciar Trichophyton

·         Agar de Urea: se utiliza para diferenciar entre levaduras e identificar diferentes especies de Trichophyton.

• Composición de los medios de cultivo

-Fuente de carbono

-Glucosa, sucrosa, fructuosa, manitol, etc.

-Fuente de nitrógeno

-Peptonas, aminoácidos, compuestos de amonio y nitratos.

-Vitaminas: Tiamina, biotina.

-Factores de crecimiento:Cualquier sustancia requerida en cantidades muy pequeñas

• Tipos de medios de cultivo
• Sólidos: cuando se necesita una gran cantidad de esporas. Agar.
•   Líquidos: cuando se necesita calcular biomasa u obtener grandes cantidades de micelio.

ANTIBIÓTICOS USADOS EN MEDIOS DE CULTIVO

• Penicilina (Gram +).
• Estreptomicina (Gram +-)
• Cloranfenicol (Gram +-).
• Garamicina (Gram +-).

REGISTRO DE CARACTERÍSTICASMACROSCÓPICAS.

• Color del anverso y reverso
• Aspecto (liso, rugosos, polvoso, etc.)
• Tamaño
• Producción de exudado
• Velocidad de crecimiento

ELABORACIÓN DE PREPARACIONES.

• Agua
• Lactofenol
• Ácido láctico
• Alcohol polivinílico
• Floxina
• Azul de algodón

• TÉCNICA DE SIEMBRA Y PROCESAMIENTO

El procesamiento debe ser inmediato. Muchas muestras se pueden sembrar inmediatamente tras su recogida.

Se debe sembrar la muestra en su totalidad. En caso de aspirado de abscesos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, etc, el volumen deberá ser de al menos 2 mL.

En el caso de que la muestra proceda de exudados vaginales: agitar la torunda en 0,5 mL de agua y sembrar, o bien sembrar con la torunda directamente.

En el caso de líquidos corporales se deberán tomar más de 2 mL y si en los líquidos hay coágulos o material membranoso, será necesario fragmentarlos con el bisturí y luego realizar la siembra.

Cuando la muestra son pelos y raspados: depositar directamente en el medio, presionando para que queden adheridos. En caso de uñas se pueden pulverizar o cortar en fragmentos.

Por último, cuando se trata de cepillados bronquiales, hay que mezclar con agua destilada y sembrar el volumen total (más de 1 mL).

-El crecimiento y desarrollo dependen de varios factores: disponibilidad de nutrimentos, pH, temperatura, humedad

• Complejos (sustratos naturales): No se sabe su composición química
• Sintéticos (Czapek): Sales inorgánicas y compuestos orgánicos
• Semi-sintéticos (PDA): Tienen un grupo desustancias conocidas y otro de sustancias naturales
• Selectivos: Son usados principalmente para aislar a grupos de hongos específicos

• Registro de características microscópicas

-Color del anverso y reverso.

-Aspecto (liso, rugosos, polvoso, etc.)

-Tamaño.

-Producción de exudado.

-Velocidad decrecimiento

Métodos de preservación

1. Aceite mineral estéril (1-10 años).

Ventajas: Los cultivos se pueden mantener por varios años y reduce la infestación de ácaros.

Desventajas: El hongo continúa creciendo y existe la selección de mutantes que puedan crecer bajo condiciones desfavorables. Es difícil drenar el aceite y en ese proceso el hongo es susceptible de contaminación.

Agua destilada y estéril (1-10 años).

Ventajas: No influye en la tasa de crecimiento ni en la viabilidad del cultivo, la estabilidad genética es mayor, se suprimen los cambios morfológicos.

Desventajas: Preservación a mediano plazo

     2. Sílica gel (8 años)

Se colocan cristales de sílica en tubos y se esterilizan con calor seco. Las esporas se suspenden en una solución al 10% de leche deslactosada. La solución de esporas se vierte en la sílica y se mantienen a temperatura ambiente durante 1 o 2semanas.Se evalúa la viabilidad y si responden bien se sellan los tubos y se mantienen a 4ºC

     3. Liofilización.

Es un proceso de deshidratación en el cual las suspensiones de esporas son congeladas. Se seca al vacío para sublimar el hielo. No todos los hongos resisten el proceso.El crioprotector se usa para evitar la deshidratación total los más usados son glutamato de sodio, peptona, varios azucares o mezclas de azucares y leche deslactosada

       4. Nitrógeno líquido (-196ºC/ 25 años).

El material se suspende en glicerol 10%, se enfría gradualmente y se coloca dentro de un tanque con N líquido a-196ºC (el vapor de N líquido está a -150ºC).Si soportan la temperatura pueden conservarse indefinidamente. Hay un cese completo de la división celular y el arresto total del metabolismo.

Ventajas: Prevención de variabilidad genética aumentada, no requieren mucho tiempo, no es laborioso, no se contamina.

Desventajas: El aparato y el nitrógeno líquido son muy caros y este último debe reemplazarse cada 2 días

• Toma de datos en el campo

-Substrato.

-Color.

-Sabor

-Olor.

 -Consistencia.

• Reacciones químicas.

-Herborización

-Deshidratación dematerial fresco.

Sirven para comparar,identificar y conservar registros

Métodos de preservación

-Los macromicetos se conservan herborizadosy se etiquetan correctamente.

-Número de especímenes colectados.

-Nombre científico completo.

-Descripción del sustrato.

-Localidad exacta.

-Nombre del colector.

-Fecha de colección.

-Nombre de la persona que determinó.