Los hongos del suelo.

Los hongos del suelo juegan un papel clave en los procesos de descomposición que mineralizan y reciclan nutrientes de plantas. En el suelo, los hongos interactúan con una compleja comunidad microbiana que incluye: bacterias, actinomicetos y pequeños invertebrados. Los hongos son una parte importante de la cadena alimenticia en el suelo, principalmente para la mesofauna que habita en el suelo .

Para poder obtener una evaluación confiable de la diversidad de los hongos del suelo, existen dos condiciones básicas. Las investigaciones deben ser diseñadas en forma de estudios a largo plazo donde intervengan especialistas en taxonomía y micología, junto con una metodología precisa. Cuando un estudio de largo plazo involucra varios especialistas no resulta viable, debido al tiempo y la limitación de los recursos.

Las metodologías para aislar y cultivar hongos de ecosistemas complejos, tales como suelos que muestran limitaciones inherentes debido a la naturaleza de las especies y la inhabilidad de los medios de cultivo para copiar con exactitud los hábitats del suelo. Incluso el análisis de abundancia relativa de especies cultivables recuperadas del suelo, puede no ser representativo de la dinámica de las comunidades del suelo, debido a que los medios de cultivo imponen nuevas condiciones selectivas y pueden introducir un sesgo en los análisis. Una medida confiable de las comunidades de hongos en el suelo sin prejuicios requiere del seguimiento de un laborioso programa de aislamientos sistemáticos, con diferentes medios de cultivos y estrategias de aislamiento, que cubran las diferentes idiosincrasias de la diversidad taxonómica y grupos fisiológicos de hongos presentes en los ecosistemas del suelo. No obstante, afirmaciones genéricas de que únicamente el 1% de los “microorganismos” del suelo son cultivables aumentan la dificultad y no tienen en cuenta la inmensa diversidad biológica que realmente representan dichos microorganismos.

Otras metodologías que han sido desarrolladas se enfocan en el análisis de la actividad de los hongos y su papel en los procesos biogeoquímicos que ocurren en el suelo. Con estos fines, se han aplicado métodos que dependen del análisis de la biomasa microbiana del suelo, respiración del suelo, reciclaje de nitrógeno y contenido de ácidos grasos del hongo o de observaciones directas del crecimiento del micelio en partículas de suelo.

Evaluación de los hongos del suelo: procedimientos basados en cultivos.

Todos los métodos propuestos dependen de muestras del suelo y no contemplan el uso de raíces para aislar hongos del suelo, debido a que la microbiota de la rizósfera es altamente influenciada por las especies de plantas.

Oomycota: uso de cebos para el aislamiento de Pythium y Phytophthora

Para poder recuperar del suelo los oomicetes es aconsejable el uso de plantas susceptibles o tejidos vegetales. Especies de Pythium y Phytophthora pueden causar serios daños a plantas cultivadas. Alícuotas de 2 g de suelo se traspasan a cajas Petri que contienen agua estéril destilada. Se añaden granos de sorgo como cebo y se incuban por cinco días; después se comprueba la presencia de micelio en el cebo. Este procedimiento deberá continuarse durante varias semanas. 

El micelio del hongo formado en el sustrato deberá traspasarse a charolas con el medio MP5 (en el caso de Saprolegniaceae) y agar con harina de maíz (AHM), agar dextrosa y papa (ADP) o agar de papa y zanahoria (en el caso de Pythiaceae) (véase Apéndice 8.1 para la composición del medio). Después de incubar durante tres a cinco días, las porciones de agar que contengan micelio serán transferidas a placas con agua estéril destilada y con dos mitades de semillas de sorgo. Al final de dicho procedimiento se deberá observar que se obtiene únicamente un aislamiento para cada placa.

 El aislamiento de hongos zoospóricos (Oomycetes, Chytridiomycetes) de muestras ambientales aparece en la ilustración 6, en la sección de color de este manual. La ilustración A) representa una muestra de suelo con cebo; la B) una muestra de agua con cebo; la C) muestra un cultivo puro en el cebo y en la D) se observa el esporangio de Phytophthora, mientras que el oogonio y anteridio de Pythium se ilustran en E)”; finalmente, en la última ilustración F), se observa la liberación de zoosporas de Pythium.

Otra técnica con sustrato susceptible utiliza muestras de suelo húmedo de 0.5g colocadas en tubos de ensayo de vidrio esterilizado con 3 ml de agua estéril. Se esterilizan en autoclave fragmentos de hojas de zacate y se añaden a los tubos como tejidos para recuperar el Pythium spp. Las muestras son incubadas durante tres a cinco días a 25°C en la oscuridad. Los tejidos infectados deben transferirse en agua estéril con el antibiótico cloranfenicol durante unas horas. El micelio en crecimiento se verifica directamente mediante montajes con agua en un microscopio o se transfiere del cebo al medio de aislamiento (AHM) que contiene cloranfenicol (50 mgL-¹) y benomil (10 mg L-¹). Pueden llevarse a cabo ensayos cuantitativos utilizando la frecuencia de la colonización relativa de los tejidos del cebo entre las réplicas de cada muestra de suelo. Las hojas de zacate como cebo pueden ser sustituidas por pedazos de frutas o verduras como pepino, tomate o papa.

Método de partículas de suelo

Una suspensión de 10 g de muestra de suelo y agua de la llave es agitada, después decantada usando un tamiz de 0.5 mm. El suelo retenido se re suspende y se pasa varias veces por el tamiz. Las partículas de suelo retenidas se secan con papel absorbente estéril y se transfieren a una caja Petri de 15 cm de diámetro que contenga un medio de agar con agua acidificada (al 2%) con 250 mg L-¹ de cloranfenicol. Después de un periodo de incubación de 24 a 48 horas, a 25°C, se verifica el crecimiento típico de Rhizoctonia; se evalúa la frecuencia de la colonización en las partículas del suelo y el micelio se transfiere a ADP para su eventual caracterización.

Ascomycota: técnica de lavado del suelo y filtración de partículas

Éste es el mayor grupo de hongos del suelo que incluye especies saprófitas, entomopatógenas, fitopatógenas y sus antagonistas. Todas estas especies exhiben una fase saprotrófica en el suelo y pueden ser aisladas utilizando una metodología con placas de suelo. La técnica de lavado de suelo es un método adecuado para el aislamiento de estas especies.

Técnica de lavado

Una muestra de 10 g de suelo mineral se agita con 200 ml de agua destilada en una centrífuga a 180 rpm durante 10 minutos. Después de la sedimentación de las partículas del suelo durante 2 minutos, el sobrenadante se desecha y se repite el procedimiento dos veces. Las partículas de suelo prelavadas son filtradas, utilizando un juego de tamices de 1.0 mm, 0.7 mm, 0.5 mm y 0.21 mm usando agua destilada (alrededor de 2 litros) por 2 minutos. Los coloidales de suelo y granos de arena son removidos del último tamiz, secados con papel absorbente esterilizado y transferidos (7 partículas por placa) a 5 cajas Petri (90 mm) que contienen el medio de aislamiento AHM (30 g L-¹), más estreptomicina plus (50 mg L-¹) para la inhibición de bacterias y ciclosporina (10 mg L-¹) o rosa de Bengala (70 mg L-¹), para la inhibición de hongos de rápido crecimiento. La frecuencia de colonización de partículas de suelo para cada especie de hongos es utilizada en ensayos cuantitativos. Cuando se emplea ciclosporina se logra una supresión casi completa de zygomycetes saprotróficos. Por lo tanto, cuando se trata de estudiar este último grupo de hongos, se debe evitar el uso de ciclosporina.

Actualmente se conocen 6,000 especies de hongos, de los cuales 2,000 son micromicetos y 4,000 macromisetos. Se estima que la biodiversidad fúngica mexicana es de más de 100,000 especies, y tan sólo se ha estudiado alrededor del 6%. A la fecha se conocen 205 especies de hongos comestibles de los cuales 112 son objeto de venta en los mercados populares  de México, particularmente en la región central del país. El total de especies comestibles presentes en México representa poco más de 10% de las 2,000 estimadas a nivel mundial, alrededor del 46% presentan   una asociación con las raíces de las plantas, llamadas micorrizas de las cuales hablaremos más adelante.