AVISO IMPORTANTE. 9° Día Nacional de los Jardines Botánicos

¿Tienes un fin de semana libre ?¿No hay planes para la familia? A toda la comunidad UNAM y al público en general se les hace la cordial invitación a asistir al 9° día Nacional de los Jardines Botánicos que se llevará a cabo en el Jardín Botanico de la UNAM ubicado en Tercer Circuito exterior, S/N. Ciudad Universitaria Coyoacán México, D.F, C.P. 04510 (a un costado del Instituto de Biología). Habrá actividades para chicos y grandes, rallys, demostraciones, visitas guiadas y mucho más. ¡ NO TE LO PUEDES PERDER !

¿Que es un hongo?

Los hongos son un grupo de seres vivos diferentes de las plantas y de los animales, razón por la cual se clasifican en un reino aparte llamado Fungi. La ciencia que los estudia se llama Micología (Mykes=Hongo y Logos=Estudio). Poseen gran capacidad de adaptación y pueden desarrollarse sobre cualquier medio o superficie, tanto en los bosques como en las ciudades. Se reproducen por medio de esporas, las cuales son diseminadas principalmente por el viento y por el agua.

Juegan un papel descomponedor, ya que transforman la materia orgánica en sustancias más simples y asimilables por otros seres vivos. Pero también pueden desarrollarse formando asociaciones de beneficio mutuo con raíces de plantas (micorrizas) y con algas dando origen a los líquenes --que son organismos totalmente diferentes a las plantas y a los mismos hongos--, mientras que algunos crecen sobre otros seres vivos produciéndoles enfermedad o incluso la muerte.

Los hongos han jugado y juegan un papel muy importante en la medicina, la industria y la alimentación. La era de los antibióticos se inicia con el descubrimiento de la penicilina, obtenida a partir del hongo Penicillium notatum; asimismo algunos hongos son importantes en la industria de quesos, cerveza, vinos y otros; además de la excelente fuente de vitaminas, proteínas, fibra y minerales que constituyen los hongos comestibles.

La palabra hongo proviene del latín fungus, que a su vez proviene del griego sphongos o esponja tal vez por la capacidad que presentan para almacenar importantes cantidades de agua.

El estudio de la taxonomía y filogenia de hongos, se ha basado en diversas técnicas desde la morfológica hasta las moleculares. Debido a la propagación sexual y asexual de los hongos se generó un sistema dual en su nomenclatura bajo el enfoque morfológico, el cual tiene grandes limitaciones, sin embargo con el desarrollo de técnicas de biología molecular, y particularmente con la estandarización para su aplicación práctica y rápida, se ha podido superar en parte esta limitación, así mismo la aplicación de estas metodologías permiten un sistema de clasificación que toma en cuenta la historia evolutiva de los hongos. Las metodologías basadas en PCR han empleado diversas técnicas tales como el RFLP, RAPD, AFLP y DAF para la identificación de hongos, y recientemente un enfoque integral (polifásico) ha revolucionado la sistemática de hongos, incluso se ha propuesto de manera formal una nueva clasificación en los taxa superiores del reino Fungi. La iniciativa del código de barras del ADN de la vida, propone una alternativa novedosa para la exploración de la diversidad biológica, además permite utilizar secuencias de ADN estandarizados para su aplicación en la identificación a nivel de especies de los hongos de manera rápida, precisa y universal, con el potencial de ser automatizada.

Estudio de hongos fitopatógenos con cámaras húmedas.

Preparación de la cámara húmeda

Definimos como cámara húmeda de laboratorio a un sistema cerrado capaz de mantener una atmósfera saturada de humedad bajo condiciones estables de temperatura.

Aplicaciones:

Simulación ambiental.

Envejecimiento acelerado.

Control de calidad.

Investigación de materiales y sistemas.

Estabilidad de productos.

Acondicionamiento en húmedo.

Investigación de especies animales y vegetales.

Características:

Diversas dimensiones y configuraciones.

Ejecución compacta o de construcción modular, en función del tamaño y aplicación.

Control preciso de temperatura y humedad relativa.

Posibilidad de simulación de ciclos climáticos.

Registro gráfico y almacenamiento de datos.

Amplia visión del interior.

Medios de cultivo

La mayoría de los hongos filamentosos y levaduras son aerobios. Son capaces de crecer a pH ácidos. Esta característica se utiliza en los medios de cultivo para inhibir el crecimiento de bacterias. Cuando se cultivan en laboratorio la mayoría de ellos crecen bien a 22-25ºC. La mayoría de los medios de cultivo generales para hongos filamentosos y levaduras contienen peptona, algún hidrato de carbono y agar. Dada la composición general de los medios de cultivo para hongos y la temperatura de incubación muchas bacterias podrían multiplicarse en estos medios. Las bacterias se harían dominantes en el medio ya que su velocidad de crecimiento es mucho mayor que la de los hongos. Por todo ello es necesario modificar los medios para impedir el crecimiento bacteriano. Para impedir el crecimiento bacteriano estos medios de cultivo generales se acidifican y/o se añaden antibióticos. Los medios de cultivo acidificados son los que se han usado tradicionalmente para el recuento de hongos y levaduras. Su pH es de alrededor de 5 lo que impide el crecimiento de muchas bacterias aunque algunos grupos de ellas (como las bacterias acidolácticas) podrían crecer. Por esta razón actualmente se prefieren los medios de cultivo con antibióticos añadidos. Son medios de cultivo generales a los que se les añade uno o varios antibióticos. algunos medio de cultivo combinan ambos efectos: es decir, son medios acidificados y además contienen uno o varios antibióticos. Son los medios más clásicos para el cultivo de hongos. El primero tiene un pH=5 y el segundo un pH=5,6. Todos ellos tienen pH neutro o próximo a la neutralidad y uno o más antibioticos añadidos. Es el medio Oxitetraciclina Glucosa Agar. Se utiliza mucho para el recuento de hongos y levaduras Es un medio de cultivo muy clásico para hongos que contiene Cloranfenicol como inhibidor del crecimiento bacteriano y, también contiene Rosa Bengala porque es un compuesto que controla el tamaño y la altura de las colonias de mohos. Es un medio de cultivo bastante utilizado para el recuento de hongos y levaduras. Es el Agar Glucosado Cloranfenicol. Los que más se utilizan son el agar "Sabouraud Cicloheximida" y el agar "Sabouraud Cloranfenicol"

Las Micorrizas

La micorriza es una asociación constituida por un conjunto de hifas fúngicas (micelio) que, al entrar en contacto con las raíces de las plantas, las pueden envolver formando un manto y penetrarlas intercelularmente a través de las células del córtex, como en el caso de la ectomicorriza o, como en el caso de la micorriza arbuscular, penetran la raíz, pero no se forma ningún manto. 

Al mismo tiempo, las hifas se ramifican en el suelo, formando una extensa red de hifas capaz de interconectar, subterráneamente, a las raíces de plantas de la misma o de diferentes especies. Esta red de micelio permite, bajo ciertas condiciones, un libre flujo de nutrimentos hacia las plantas hospederas y entre las raíces de las plantas interconectadas, lo que sugiere que la micorriza establece una gran unión bajo el suelo entre plantas que, a simple vista, podrían parecer lejanas y sin ninguna relación. Así, la micorriza ofrece a la planta hospedera y al ecosistema, diferentes beneficios en términos de sobrevivencia y funcionamiento.

El término "micorriza" fue acuñado por Frank, patólogo forestal alemán, en 1877, al estudiar las raíces de algunos árboles forestales. Para 1900, el botánico francés Bernard resaltó su importancia al estudiar las orquídeas. Trappe (1994) define a las micorrizas en términos funcionales y estructurales, como "órganos de absorción dobles que se forman cuando los hongos simbiontes viven dentro de los órganos de absorción sanos (raíces, rizomas o talos) de las plantas terrestres, acuáticas o epífitas". En esta asociación, la planta le proporciona al hongo carbohidratos (azúcares, producto de su fotosíntesis) y un microhábitat para completar su ciclo de vida; mientras que el hongo, a su vez, le permite a la planta una mejor captación de agua y nutrimentos minerales con baja disponibilidad en el suelo (principalmente fósforo), así como defensas contra patógenos. Ambos, hongo y planta, salen mutuamente beneficiados, por lo que la asociación se considera como un "mutualismo". Evidencias fósiles y estudios moleculares sugieren que la asociación micorrícica se originó hace ca. 462-353 millones de años y, desde entonces, su formación es indispensable para el éxito ecológico de la mayoría de las plantas sobre la Tierra.

La función principal de la micorriza es facilitarle a la planta la adquisición y absorción de agua, fósforo y nitrógeno, principalmente; sin embargo, esta asociación proporciona otros beneficios a las plantas, entre los que destacan: la protección ante el ataque de parásitos, hongos patógenos y nemátodos, el aumento de su resistencia a la herbívora, influyendo en la producción de sustancias defensivas por parte de la misma planta, la limitación de la absorción de metales pesados tóxicos como el zinc y el cadmio que son alojados en sus hifas, aumento del área de exploración de la raíz, lo que incrementa el flujo de agua del suelo a la planta (ver revisiones hechas por Camargo-Ricalde, 1999; 2001; 2002); además de mejorar las propiedades físicas y químicas del suelo mediante el enriquecimiento de materia orgánica y la formación de agregados por medio de la adhesión de partículas debida a una proteína exudada por el micelio, la glomalina, contribuyendo a darle estructura y estabilidad al suelo, lo que reduce su erosión y mejora su capacidad de retención de agua (Guadarrama et al., 2004; Finlay, 2008).

Las especies vegetales que forman micorrizas presentan una fisiología y una ecología diferentes de aquéllas que no forman esta asociación y se considera a la asociación micorrícica como uno de los factores promotores de la diversidad vegetal, al aumentar la adecuación de las plantas (supervivencia, crecimiento y reproducción) y facilitar su establecimiento, incluso bajo condiciones de estrés ambiental, lo cual tiene un impacto positivo en la diversidad de plantas, tanto a una escala poblacional como de las comunidades vegetales (Van der Heijden, 2002).

Además, como parte de la cadena trófica, las hifas de estos hongos son consumidas por la fauna del suelo, como los nemátodos y los microartrópodos. Asimismo, las hifas constituyen una parte importante de la biomasa del suelo y son un importante sumidero de carbono, ya que los hongos micorrizógenos asociados a las especies vegetales reciben entre el 57% y 90% del carbono de los árboles, y llegan a representar hasta el 50% de la biomasa microbiana total del suelo (Olsson et al., 1999). Existen estudios que reportan que la micorriza genera una extensa red de micelio externo que explora el suelo en la búsqueda de recursos (por ejemplo nutrimentos y agua) e interconecta a las raíces de plantas de la misma especie e, incluso, de especies diferentes (Simard y Durall, 2004). Usando técnicas isotópicas para marcar el carbono (C14), estos estudios han demostrado que las plantas interconectadas por la red micorrícica pueden transferir carbono entre ellas (Simard et al., 1997; Finlay, 2008; Smith y Read, 1998), de tal manera que aquellas plantas que, aparentemente parecerían a simple vista no tener una relación cercana, están comunicadas con otras plantas por medio de las redes de micelio que están en el suelo.

Igualmente, ante los problemas ambientales y ecológicos que enfrentamos hoy en día, la asociación micorrícica nos ofrece múltiples beneficios, debido a que las plantas micorrizadas, ya sean de interés agrícola o forestal, son más resistentes a condiciones ambientales adversas, como: la falta de agua y de nutrimentos esenciales, y el ataque de microorganismos fitopatógenos o plagas, además de estimular un mayor crecimiento (biomasa) y una mejor adecuación (figura 5) (Finlay, 2008; Smith y Read, 1998).

Actualmente, la asociación micorrícica se considera fundamental en las prácticas agrosilvopastoriles sostenibles y en los programas de restauración ambiental, ya que aumenta sus posibilidades de éxito.

Los hongos del suelo.

Los hongos del suelo juegan un papel clave en los procesos de descomposición que mineralizan y reciclan nutrientes de plantas. En el suelo, los hongos interactúan con una compleja comunidad microbiana que incluye: bacterias, actinomicetos y pequeños invertebrados. Los hongos son una parte importante de la cadena alimenticia en el suelo, principalmente para la mesofauna que habita en el suelo .

Para poder obtener una evaluación confiable de la diversidad de los hongos del suelo, existen dos condiciones básicas. Las investigaciones deben ser diseñadas en forma de estudios a largo plazo donde intervengan especialistas en taxonomía y micología, junto con una metodología precisa. Cuando un estudio de largo plazo involucra varios especialistas no resulta viable, debido al tiempo y la limitación de los recursos.

Las metodologías para aislar y cultivar hongos de ecosistemas complejos, tales como suelos que muestran limitaciones inherentes debido a la naturaleza de las especies y la inhabilidad de los medios de cultivo para copiar con exactitud los hábitats del suelo. Incluso el análisis de abundancia relativa de especies cultivables recuperadas del suelo, puede no ser representativo de la dinámica de las comunidades del suelo, debido a que los medios de cultivo imponen nuevas condiciones selectivas y pueden introducir un sesgo en los análisis. Una medida confiable de las comunidades de hongos en el suelo sin prejuicios requiere del seguimiento de un laborioso programa de aislamientos sistemáticos, con diferentes medios de cultivos y estrategias de aislamiento, que cubran las diferentes idiosincrasias de la diversidad taxonómica y grupos fisiológicos de hongos presentes en los ecosistemas del suelo. No obstante, afirmaciones genéricas de que únicamente el 1% de los “microorganismos” del suelo son cultivables aumentan la dificultad y no tienen en cuenta la inmensa diversidad biológica que realmente representan dichos microorganismos.

Otras metodologías que han sido desarrolladas se enfocan en el análisis de la actividad de los hongos y su papel en los procesos biogeoquímicos que ocurren en el suelo. Con estos fines, se han aplicado métodos que dependen del análisis de la biomasa microbiana del suelo, respiración del suelo, reciclaje de nitrógeno y contenido de ácidos grasos del hongo o de observaciones directas del crecimiento del micelio en partículas de suelo.

Evaluación de los hongos del suelo: procedimientos basados en cultivos.

Todos los métodos propuestos dependen de muestras del suelo y no contemplan el uso de raíces para aislar hongos del suelo, debido a que la microbiota de la rizósfera es altamente influenciada por las especies de plantas.

Oomycota: uso de cebos para el aislamiento de Pythium y Phytophthora

Para poder recuperar del suelo los oomicetes es aconsejable el uso de plantas susceptibles o tejidos vegetales. Especies de Pythium y Phytophthora pueden causar serios daños a plantas cultivadas. Alícuotas de 2 g de suelo se traspasan a cajas Petri que contienen agua estéril destilada. Se añaden granos de sorgo como cebo y se incuban por cinco días; después se comprueba la presencia de micelio en el cebo. Este procedimiento deberá continuarse durante varias semanas. 

El micelio del hongo formado en el sustrato deberá traspasarse a charolas con el medio MP5 (en el caso de Saprolegniaceae) y agar con harina de maíz (AHM), agar dextrosa y papa (ADP) o agar de papa y zanahoria (en el caso de Pythiaceae) (véase Apéndice 8.1 para la composición del medio). Después de incubar durante tres a cinco días, las porciones de agar que contengan micelio serán transferidas a placas con agua estéril destilada y con dos mitades de semillas de sorgo. Al final de dicho procedimiento se deberá observar que se obtiene únicamente un aislamiento para cada placa.

 El aislamiento de hongos zoospóricos (Oomycetes, Chytridiomycetes) de muestras ambientales aparece en la ilustración 6, en la sección de color de este manual. La ilustración A) representa una muestra de suelo con cebo; la B) una muestra de agua con cebo; la C) muestra un cultivo puro en el cebo y en la D) se observa el esporangio de Phytophthora, mientras que el oogonio y anteridio de Pythium se ilustran en E)”; finalmente, en la última ilustración F), se observa la liberación de zoosporas de Pythium.

Otra técnica con sustrato susceptible utiliza muestras de suelo húmedo de 0.5g colocadas en tubos de ensayo de vidrio esterilizado con 3 ml de agua estéril. Se esterilizan en autoclave fragmentos de hojas de zacate y se añaden a los tubos como tejidos para recuperar el Pythium spp. Las muestras son incubadas durante tres a cinco días a 25°C en la oscuridad. Los tejidos infectados deben transferirse en agua estéril con el antibiótico cloranfenicol durante unas horas. El micelio en crecimiento se verifica directamente mediante montajes con agua en un microscopio o se transfiere del cebo al medio de aislamiento (AHM) que contiene cloranfenicol (50 mgL-¹) y benomil (10 mg L-¹). Pueden llevarse a cabo ensayos cuantitativos utilizando la frecuencia de la colonización relativa de los tejidos del cebo entre las réplicas de cada muestra de suelo. Las hojas de zacate como cebo pueden ser sustituidas por pedazos de frutas o verduras como pepino, tomate o papa.

Método de partículas de suelo

Una suspensión de 10 g de muestra de suelo y agua de la llave es agitada, después decantada usando un tamiz de 0.5 mm. El suelo retenido se re suspende y se pasa varias veces por el tamiz. Las partículas de suelo retenidas se secan con papel absorbente estéril y se transfieren a una caja Petri de 15 cm de diámetro que contenga un medio de agar con agua acidificada (al 2%) con 250 mg L-¹ de cloranfenicol. Después de un periodo de incubación de 24 a 48 horas, a 25°C, se verifica el crecimiento típico de Rhizoctonia; se evalúa la frecuencia de la colonización en las partículas del suelo y el micelio se transfiere a ADP para su eventual caracterización.

Ascomycota: técnica de lavado del suelo y filtración de partículas

Éste es el mayor grupo de hongos del suelo que incluye especies saprófitas, entomopatógenas, fitopatógenas y sus antagonistas. Todas estas especies exhiben una fase saprotrófica en el suelo y pueden ser aisladas utilizando una metodología con placas de suelo. La técnica de lavado de suelo es un método adecuado para el aislamiento de estas especies.

Técnica de lavado

Una muestra de 10 g de suelo mineral se agita con 200 ml de agua destilada en una centrífuga a 180 rpm durante 10 minutos. Después de la sedimentación de las partículas del suelo durante 2 minutos, el sobrenadante se desecha y se repite el procedimiento dos veces. Las partículas de suelo prelavadas son filtradas, utilizando un juego de tamices de 1.0 mm, 0.7 mm, 0.5 mm y 0.21 mm usando agua destilada (alrededor de 2 litros) por 2 minutos. Los coloidales de suelo y granos de arena son removidos del último tamiz, secados con papel absorbente esterilizado y transferidos (7 partículas por placa) a 5 cajas Petri (90 mm) que contienen el medio de aislamiento AHM (30 g L-¹), más estreptomicina plus (50 mg L-¹) para la inhibición de bacterias y ciclosporina (10 mg L-¹) o rosa de Bengala (70 mg L-¹), para la inhibición de hongos de rápido crecimiento. La frecuencia de colonización de partículas de suelo para cada especie de hongos es utilizada en ensayos cuantitativos. Cuando se emplea ciclosporina se logra una supresión casi completa de zygomycetes saprotróficos. Por lo tanto, cuando se trata de estudiar este último grupo de hongos, se debe evitar el uso de ciclosporina.

Actualmente se conocen 6,000 especies de hongos, de los cuales 2,000 son micromicetos y 4,000 macromisetos. Se estima que la biodiversidad fúngica mexicana es de más de 100,000 especies, y tan sólo se ha estudiado alrededor del 6%. A la fecha se conocen 205 especies de hongos comestibles de los cuales 112 son objeto de venta en los mercados populares  de México, particularmente en la región central del país. El total de especies comestibles presentes en México representa poco más de 10% de las 2,000 estimadas a nivel mundial, alrededor del 46% presentan   una asociación con las raíces de las plantas, llamadas micorrizas de las cuales hablaremos más adelante.

Metodologías de identificación en hongos.

Los hongos están asociados a diversas causas de enfermedad, así como en interacciones biológicas y procesos bioquímicos, por lo cual su identificación es importante no solo en el campo de la salud, sino también en patologías de plantas, biodeterioro, aplicaciones biotecnológicas y en investigaciones ambientales. La mayor parte de las especies de hongos, fueron identificados y clasificados tomando en cuenta solo el enfoque morfológico (características fenotípicas), no obstante otros grupos fueron examinados desde diversos aspectos (fisiológicos, bioquímicos, composición de la pared celular y de proteínas, y técnicas moleculares) debido a su importancia económica y/o médica (Guarro y col., 1999; Balajee y col., 2009).

Nomenclatura de hongos

En la sistemática de organismos, por lo general cuando es descubierto un nuevo individuo debe ser descrito bajo los lineamientos aceptados a nivel internacional, el nombre se le asignará bajo el sistema binomial latinizado, propuesto por Carl von Linneo (S. XVII). Dicha sistematización en la clasificación de especies tiene el objetivo de establecer lineamientos con reglas claras y concretas, para evitar y rechazar nombres que causen confusión (Guarro y col., 1999).

La nomenclatura de los grupos biológicos está normada por diversos códigos, la cual depende del tipo de organismo (plantas, bacterias, virus y animales) para el caso de la taxonomía de hongos incluyendo las levaduras, se basa en los lineamientos de la ICBN (International Code of Botanical Nomenclature) (Greuter y col., 1994).

Los hongos se propagan de forma sexual (teleomorfos) y asexual (anamorfos) debido a esto se ha formado una nomenclatura dual para su identificación, la cual está aceptado por la ICBN. Holomorfo es un terminó reservado para aquellos hongos que presentan esporulación teleomórfica y anamórfica al mismo tiempo, un ejemplo de ellos son los zigomicetos. Así mismo es importante señalar que la descripción de los hongos se dio bajo circunstancias desconocidas hasta entonces de la existencia de sus fases sexuales (Gams, 1995; Guarro y col., 1999).

Identificación morfológica

La identificación y clasificación de los hongos a diferencia de otros microorganismos (bacterias y virus) se ha basado principalmente sobre criterios morfológicos. La microscopia de luz ha sido la herramienta más utilizada, con algunas mejoras como la fluorescencia, citoquímica y el desarrollo de nuevas técnicas de teñido para las estructuras apicales de las ascas (Guarro y col., 1999).

Por lo general los hongos cultivados en condiciones de laboratorio solo desarrollan las características de la fase asexual y en muy raras ocasiones las de la fase teleomorfa. Por lo cual la identificación de anamorfos se basa principalmente en el tipo de conidio y procesos de conidiogénesis (Hennebert y Sutton, 1994). Sin embargo varias características asociados a la fase teleomorfa son útiles para su identificación y clasificación, por ejemplo el tipo de cuerpo fructificante (basidiomas, ascomas) y el tipo de ascas (microscópicas y globosas) (Guarro y col., 1999).

Estudios en la pared celular de los hongos por microscopia electrónica de transmisión, han permitido diferenciar los ascomicetos de basidiomicetos. A menudo los detalles en la superficie de las ascosporas ha facilitado la identificación a nivel de especie en algunos ascomicetos (De Hoog y Guarro, 1995; Kurtzman y Fell, 1998).

La identificación de hongos, basado en el enfoque fenotípico siempre ha sido criticada por la falta de una terminología universal y objetiva, así mismo las características morfológicas están sujetas a la variación de las condiciones ambientales (Guarro y col., 1999). Además el sistema dual de clasificación (teleomorfos y anamorfos) basado en el enfoque fenotípico, no establece una coherente correlación entre las taxonomías de los ascomicetos y deuteromicetos (Hennebert y Sutton, 1994).

Técnicas bioquímicas de identificación de hongos

 Metabolitos secundarios

Los metabolitos secundarios son compuestos no esenciales, ni intermediarios clave en el metabolismo del individuo, sin embargo es posible que desempeñe otro rol en el desarrollo de los hongos. Por lo general se encuentran como una mezcla de moléculas de estructura química rara, los más comunes pueden ser esteroides, terpenos, alcaloides, ciclopéptidos y cumarinas, algunos de éstos compuestos son micotoxinas (Hawksworth y col.,1995).

Las mejoras en la cromatografía de capa fina ha permitido identificar de manera más rápida los metabolitos secundarios, que con las técnicas convencionales (extracción, purificación y concentración). El perfil de metabolitos secundarios, ha sido útil para la identificación y clasificación de líquenes, pero el método se ha empleado de forma reservada en la taxonomía de los Ascomycetes y Basidiomycetes, debido a que la producción de tales compuestos pueden estar influidos por las condiciones ambientales, así como por las dificultades que se presentan en la técnica (Carlile y Watkinson, 1994). Sin embargo, su potencial se ha demostrado en estudios realizados en los órdenes Eurotiales y Xylariales (phylum Ascomycota), las especies pueden ser identificadas sobre la base de sus perfiles de metabolitos (Frisvad, 1994; Whalley y Edwards, 1995).

Ubiquinonas

Además de los metabolitos secundarios, en taxonomía de hongos también se han utilizado otros compuestos que desempeñan un rol esencial en el metabolismo, como es el caso de las ubiquinonas (coenzima Q), éstos compuestos desempeñan un papel importante en la cadena del transporte de electrones del sistema respiratorio (Carlile y Watkinson, 1994). Se sabe que el número de isoprenos adheridas al núcleo de la quinona es variable, y tales diferencias se emplean para la clasificación (género y subgénero) en levaduras; sin embargo para las levaduras negras y hongos filamentosos el método se ha utilizado de forma limitada (Yaguchi y col., 1996) debido a que las conclusiones basadas solo en el sistema de ubiquinona son debatibles, así mismo dependiendo del método utilizado es posible obtener diferente conjuntos de datos (Samson, 1991).

 Composición de ácidos grasos

La composición de ácidos grasos celulares, se emplea rutinariamente en la taxonomía bacteriana. El tipo de ácido graso y su concentración relativa son las características que se utilizan para la separación de taxones, éstas técnicas raramente se empleaban en hongos, sin embargo algunos ácidos grasos son producidos por hongos y no por las bacterias (Veys y col., 1989). Estos análisis se utilizan cada vez más en la taxonomía de hongos (Stahl y Klug, 1996).

La cromatografía de gases, en combinación con los métodos de análisis multivariado, se ha empleado con éxito en estudios de ácidos grasos en hongos filamentosos, incluyendo Oomycetes, Zygomycetes, Basidiomycetes, además de mycelia sterilia. Sin embargo, los aspectos técnicos del procedimiento deben ser estandarizados y controlados para minimizar las fuentes de variación debido a que pueden influir en los resultados; entre los factores más importantes a ser normalizados son las condiciones de cultivo y la temperatura (Stahl y Klug, 1996).

 Composición de la pared celular

Estudios en la pared celular de los hongos, han demostrado diferencias en su estructura y composición, lo cual se ha utilizado para definir taxa superiores. La celulosa es un componente particular de la fracción alcalino-soluble en Oomycetes, por el contrario en Ascomycetesy Basidiomycetes contienen quitina y glucano en estas fracciones, y en Zygomycetes se presentan el quitosano y el ácido poliglucorónico. Así mismo variaciones significativas en la composición de azúcares de la pared celular se han observado en géneros de dermatofitos (Guarro y col., 1993). La presencia o ausencia y la diferencia en cantidad de algunos polisacáridos como la glucosa, manosa, fucosa, galactosa, ramnosa y xilosa son característica que se han empleado en la clasificación de hongos (Carlile y Watkinson, 1994).

 Composición proteica

Los patrones de isoenzimas (zimogramas) han permitido diferenciar especies y establecer relaciones generales (Murphy y col., 1990). La secuenciación de proteínas y los métodos inmunológicos también se utilizan para la caracterización interespecífica debido a su adecuada resolución (Kohn, 1992). El empleo de los zimogramas se considera una técnica económica y práctica para la detección de especies en grandes poblaciones; las aloenzimas (isoenzima alélica) son generalmente utilizadas en estudios filogenéticos (Kohn, 1992)

Técnicas moleculares-técnicas basadas en PCR

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (Polymerase Chain Reaction) es una tecnología que consiste en amplificar in vitro fragmentos específicos de ADN, con la finalidad de detectar una secuencia o gen de interés en el genoma de un organismo. En 1985 Kary B. Mullis patentó y público su invención (PCR), desde la fecha se ha empleado con éxito en diferentes campos del conocimiento como en la medicina, biología, agronomía, áreas forense y taxonomía (Dale y von-Schantz, 2007).

La PCR consiste en tres pasos esenciales: 

a) Desnaturalización del ADN, sirve para separar por temperatura (94°C) el ADN de doble cadena a moléculas de cadena sencilla, que servirán de molde para la síntesis de los fragmentos.

 b) Alineamiento, la temperatura se reduce para permitir el reconocimiento de los oligonucleótidos a las cadenas moldes, la temperatura optima de alineamiento pude variar desde los 40 a 65 °C, y dependerá de las características de los oligonucleótidos (su longitud, composición de bases nitrogenadas y especificidad).

c) Extensión, el ADN polimerasa producirá la cadena de ADN complementaria a partir de los oligonucleótidos unidos a las cadenas moldes, la temperatura de extensión optima es aproximadamente a 72°C; la enzima ADN Taq polimerasa agrega aproximadamente 1000 bases por minuto. Estos pasos (ciclo) se repiten las veces que sea necesario, para obtener de manera exponencial el fragmento de interés (en 30 a 40 ciclos se acumula alrededor de 106 a 108 moléculas) a partir de la muestra de ADN (Dale y von-Schantz, 2007; Valdez y Kahl, 2005).

Los procesos de replicación de ADN tienen alta fidelidad, sin embargo el genoma de los hongos es dinámico, en la cual pueden ocurrir eventos de sustitución, inserción, deleción, transposición, rearreglos en regiones génicas o en cromosomas, movimiento de genes desde los orgánulos hacia el núcleo, así como la adquisición de elementos génicos de otros organismos. Por lo tanto el genoma de los hongos presenta varias regiones de ADN cuyas características pueden ser analizadas en cualquier especie fúngica, para lo cual se han desarrollado diversas técnicas (a menudo con desconcertante siglas) para estudiar la variación genética de los organismos incluyendo los hongos (Piercey-Normore y Egger, 2001).

Colecta, cultivo y preservación.

Colecta

Muestras de la Piel: se deben recoger abundantes escamas de la zona lesionada, preferiblemente de los bordes o bien pasar un trozo de moqueta especial y estéril varias veces por la lesión.

Muestras de la Cabeza: recoger las escamas, los pelos (con raíz) o pasar la moqueta.

Muestras de las Uñas: tomar fragmentos pequeños de las uñas, o un raspado subungueal. Si hay un exudado perungueal se recogerá la muestra con una torunda estéril.

Lesiones en pliegues (interdigitales, unguinales, submamarios, labiales,...): recoger escamas o pasar la moqueta. Si la lesión es exudativa y no se pueden recoger escamas, la muestra se tomará con una torunda o mediante pases de moqueta.                                                                                                               

Lesiones en mucosas oral, balanoprepucial, etc: se recogerá un exudado mediante una torunda. Se tomarán preferiblemente dos muestras, una para examen microscópico y otra para la siembra en un medio de cultivo.

Podemos colectar:

• Hongos macroscópicos
• Hongos microscópicos

Se pueden Aislar mediante:

• Transferencia  directa
• Dilución en placa
• Esterilización superficial
• Utilización de carnadas
• Cámaras  húmedas

Cultivo de microorganismos

• Proceso de inducir su crecimiento
• El cultivo in vitro necesita la preparación de sustancias que el hongo pueda utilizar como alimento: Medios de Cultivo.

Medios de cultivo

Para el aislamiento primario de los hongos, se utilizan diversos medios de cultivo. Estos medios hay que seleccionarlos en función del hongo que se sospeche y del tipo de muestra.

Los medios de cultivo se pueden utilizar en tubos cerrados con tapón de rosca o en placas de petri. La gran superficie de estas últimas facilita el aislamiento y la dilución de sustancias inhibitorias en las muestras. Es importante que el medio no se deseque por lo que el espesor de las mismas debe ser por lo menos de 25 mm, aproximadamente 35-40 mL de medio. Las placas se contaminan con facilidad durante la incubación por lo que es aconsejable sellarlas con cinta adhesiva. Los medios en tubo tienen la ventaja de que no se deshidratan y se contaminan menos, pero en cambio tienen menos superficie.

Si la muestra es de una zona contaminada se deben incluir medios que contengan Cloranfenicol y Cicloheximida. El primero inhibe los contaminantes bacterianos y el segundo inhibe el crecimiento de hongos saprofitos. Hay algunas especies patógenas que pueden ser inhibidas por ambos, por esta razón es importante usar medios con y sin agentes inhibidores. Las muestras de zonas estériles pueden inocularse en medios sin sustancias inhibitorias.

La temperatura de incubación debe ser seleccionada teniendo en cuenta el tipo de hongo, en general, los medios deben incubarse a 25ºC y a 37ºC durante 4 semanas antes de considerarse como negativos. Si se emplean tubos con tapón de rosca deben estar flojos para permitir la entrada de aire.

Medios más utilizados

·         Agar Dextrosado de Saboureaud con Cicloheximida y Cloranfenicol: se utiliza para el aislamiento e identificación de dermatófitos y Cándidas.

·         Agar Dextrosado con Cloranfenicol sin Cicloheximida: se utiliza para el aislamiento e identificación de patógenos ambientales y oportunitas.

·         Agar de harina de maíz (“Corn Meal Agar”):

o    Suplementado con Tween 80: para diferenciar distintas especies de Cándida y para realizar subcultivos ya que estimula la esporulación de hongos miceliales.

o    Suplementado con 10 gramos de Glucosa: para diferenciar Trichophyton

·         Agar de Urea: se utiliza para diferenciar entre levaduras e identificar diferentes especies de Trichophyton.

• Composición de los medios de cultivo

-Fuente de carbono

-Glucosa, sucrosa, fructuosa, manitol, etc.

-Fuente de nitrógeno

-Peptonas, aminoácidos, compuestos de amonio y nitratos.

-Vitaminas: Tiamina, biotina.

-Factores de crecimiento:Cualquier sustancia requerida en cantidades muy pequeñas

• Tipos de medios de cultivo
• Sólidos: cuando se necesita una gran cantidad de esporas. Agar.
•   Líquidos: cuando se necesita calcular biomasa u obtener grandes cantidades de micelio.

ANTIBIÓTICOS USADOS EN MEDIOS DE CULTIVO

• Penicilina (Gram +).
• Estreptomicina (Gram +-)
• Cloranfenicol (Gram +-).
• Garamicina (Gram +-).

REGISTRO DE CARACTERÍSTICASMACROSCÓPICAS.

• Color del anverso y reverso
• Aspecto (liso, rugosos, polvoso, etc.)
• Tamaño
• Producción de exudado
• Velocidad de crecimiento

ELABORACIÓN DE PREPARACIONES.

• Agua
• Lactofenol
• Ácido láctico
• Alcohol polivinílico
• Floxina
• Azul de algodón

• TÉCNICA DE SIEMBRA Y PROCESAMIENTO

El procesamiento debe ser inmediato. Muchas muestras se pueden sembrar inmediatamente tras su recogida.

Se debe sembrar la muestra en su totalidad. En caso de aspirado de abscesos, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, etc, el volumen deberá ser de al menos 2 mL.

En el caso de que la muestra proceda de exudados vaginales: agitar la torunda en 0,5 mL de agua y sembrar, o bien sembrar con la torunda directamente.

En el caso de líquidos corporales se deberán tomar más de 2 mL y si en los líquidos hay coágulos o material membranoso, será necesario fragmentarlos con el bisturí y luego realizar la siembra.

Cuando la muestra son pelos y raspados: depositar directamente en el medio, presionando para que queden adheridos. En caso de uñas se pueden pulverizar o cortar en fragmentos.

Por último, cuando se trata de cepillados bronquiales, hay que mezclar con agua destilada y sembrar el volumen total (más de 1 mL).

-El crecimiento y desarrollo dependen de varios factores: disponibilidad de nutrimentos, pH, temperatura, humedad

• Complejos (sustratos naturales): No se sabe su composición química
• Sintéticos (Czapek): Sales inorgánicas y compuestos orgánicos
• Semi-sintéticos (PDA): Tienen un grupo desustancias conocidas y otro de sustancias naturales
• Selectivos: Son usados principalmente para aislar a grupos de hongos específicos

• Registro de características microscópicas

-Color del anverso y reverso.

-Aspecto (liso, rugosos, polvoso, etc.)

-Tamaño.

-Producción de exudado.

-Velocidad decrecimiento

Métodos de preservación

1. Aceite mineral estéril (1-10 años).

Ventajas: Los cultivos se pueden mantener por varios años y reduce la infestación de ácaros.

Desventajas: El hongo continúa creciendo y existe la selección de mutantes que puedan crecer bajo condiciones desfavorables. Es difícil drenar el aceite y en ese proceso el hongo es susceptible de contaminación.

Agua destilada y estéril (1-10 años).

Ventajas: No influye en la tasa de crecimiento ni en la viabilidad del cultivo, la estabilidad genética es mayor, se suprimen los cambios morfológicos.

Desventajas: Preservación a mediano plazo

     2. Sílica gel (8 años)

Se colocan cristales de sílica en tubos y se esterilizan con calor seco. Las esporas se suspenden en una solución al 10% de leche deslactosada. La solución de esporas se vierte en la sílica y se mantienen a temperatura ambiente durante 1 o 2semanas.Se evalúa la viabilidad y si responden bien se sellan los tubos y se mantienen a 4ºC

     3. Liofilización.

Es un proceso de deshidratación en el cual las suspensiones de esporas son congeladas. Se seca al vacío para sublimar el hielo. No todos los hongos resisten el proceso.El crioprotector se usa para evitar la deshidratación total los más usados son glutamato de sodio, peptona, varios azucares o mezclas de azucares y leche deslactosada

       4. Nitrógeno líquido (-196ºC/ 25 años).

El material se suspende en glicerol 10%, se enfría gradualmente y se coloca dentro de un tanque con N líquido a-196ºC (el vapor de N líquido está a -150ºC).Si soportan la temperatura pueden conservarse indefinidamente. Hay un cese completo de la división celular y el arresto total del metabolismo.

Ventajas: Prevención de variabilidad genética aumentada, no requieren mucho tiempo, no es laborioso, no se contamina.

Desventajas: El aparato y el nitrógeno líquido son muy caros y este último debe reemplazarse cada 2 días

• Toma de datos en el campo

-Substrato.

-Color.

-Sabor

-Olor.

 -Consistencia.

• Reacciones químicas.

-Herborización

-Deshidratación dematerial fresco.

Sirven para comparar,identificar y conservar registros

Métodos de preservación

-Los macromicetos se conservan herborizadosy se etiquetan correctamente.

-Número de especímenes colectados.

-Nombre científico completo.

-Descripción del sustrato.

-Localidad exacta.

-Nombre del colector.

-Fecha de colección.

-Nombre de la persona que determinó.

Estructuras de los hongos

Somáticas

Estructuras Somáticas.

Micelio es el conjunto de filamentos y un trozo del mismo se denomina hifa. Las hifas pueden presentar septos y entonces el micelio está tabicado. Septos primarios son los formados cuando hay división nuclear y adventicios los otros. Si los tabiques están ausentes se habla de micelio continuo. Los mohos son micromicetos filamentosos. Cuando el hongo es una célula aislada se dice unicelular o levadura. Los cortos filamentos compuestos por las células que brotan de una levadura constituyen el pseudomicelio. Plecténquima es un conjunto de hifas entrelazadas que se asemejan a un tejido. Se dice prosénquima si las hifas pueden ser reconocidas y pseudoparénquima cuando han perdido su individualidad. Esclerocio es un plecténquima generalmente macroscópico que puede permanecer en vida latente. Rizomorfa es un cordón grueso donde el conjunto de las hifas fusionadas ha tomado el aspecto de raíz. Rizoides son las hifas de succión, como raicillas, que penetran en el substrato. Haustorio es la hifa de succión del hongo parásito dentro de la célula del hospedador. Apresorios son unas hifas achatadas que se adhieren al substrato o al hospedador como sostén, especialmente en el comienzo de la infección.

Reproductoras

Anamorfo es el hongo con multiplicación asexuada y teleomorfo es el mismo con reproducción sexuada. Se les asigna distinto género y especie. Holomorfo indica el ciclo de vida total.  

Esporas son los elementos de perpetuación de la especie. De acuerdo a la morfología reciben distinto nombre: alantospora con forma de banana, aleuriospora con base plana, dictiosporacon septos longitudinales y transversales, didimospora con un tabique, equinulada como un erizo, escolescospora como un gusano, estaurospora como una estrella, feospora de color obscuro, fragmospora con tabiques transversales, fusiforme como un huso, helicospora como una espiral, hialospora de color claro y translúcido, planospora móvil, verrucosa con verrugas, zoospora con flagelos. Las balistosporas son proyectados violentamente una vez maduras. Las hipnosporas son aquéllas capaces de permanecer con vida latente por largo tiempo.  Las esporas pueden ser de origen asexuado (mitosporas) o sexuado (meiosporas), y por su ubicación relativa internas o externas. Las mitosporas se originan en las estructuras anamórficas y las meiosporas en las teleomórficas. 

Anamórficas

Artrosporas o artroconidios son esporas desarrolladas en una hifa terminal que al 

madurar se separan. En algunos hongos se forman artrosporas separadas por una zona 

libre de citoplasma (disyuntor) cuya pared se rompe liberando las entosporas o clamido-artrosporas. Clamidospora o clamidoconidio es una hipnospora o célula de resistencia, terminal o interh ifal, con pared gruesa y substancias de reserva. Blastosporas o blastoconidios son las esporas que se originan de una parte de una célula somática, una hifa, un conidióforo u otra espora, y se desarrollan antes de la 

formación del septo que lo separa de la célula de origen.Conidios o conidiosporas son las esporas asexuadas externas. Si están implantadas directamente sobre la hifa se llaman sésiles. La parte del micelio que origina y sostiene a las esporas se denomina esporóforo y si se trata de conidios se dice conidióforo. Fiálide es la célula conidiógena que desde un extremo origina por brotación y sin aumentar su longitud, los fialoconidios o fialosporas. La pared de la fiálide suele extenderse en el ápice formando un collarín. Anélide es una célula conidiógena con el ápice ancho y cicatrices en anillo, que se alarga con la formación de cada espora. Los conidióforos pueden ser simples o ramificados y a veces están agrupados en un conidioma. En Penicillium cada nivel de ramificaciones recibe distinto nombre, se llama métulas a las que sostienen a las fiálides productoras de esporas. En Aspergillus las fiálides o las métulas están implantadas sobre una vesícula o dilatación del esporóforo.  Los conidios nacen de los conidióforos aisladamente o quedan reunidos, ya sea en una cabezuela mucosa o en cadenas. Éstas se forman por sucesión basípeta cuando todos las esporas surgen de la célula conidiógena o basífuga si es por brotación de la espora anterior. A veces después que se forma un conidio, el conidióforo se alarga lateralmente y origina el segundo conidio. El proceso continúa y las esporas quedan en zig-zag (proliferación simpodial). En algunos hongos surgen, simultáneamente o no, varios conidios en diferentes puntos de la misma célula conidiógena (brotación múltiple).  Los conidióforos suelen estar reunidos en un haz llamado coremio o sobre un conjunto de hifas entrelazadas constituyendo un conidioma, ya sea un esporodoquio (almohadilla de fiálides con las esporas expuestas) o una acérvula (estructura chata y cubierta al principio por el tejido del hospedador donde los esporóforos están en empalizada).

Funículo es una cuerda de hifas de las cuales surgen, a intervalos, los conidióforos. Picnidio es un conidioma globoso o en forma de pera, cuya pared plectenquimatosa está recubierta internamente por las células conidiógenas y está abierto por un ostíolo. Las esporas originadas se llaman picnidiosporas. También la cavidad picnidial puede estar encerrada en una estructura somática compacta denominada estroma.  Esporangio es una estructura globosa con una membrana peridial simple, generalmente en el extremo de un esporangióforo, que contiene innumerables esporangiosporas. El ápice dilatado del esporangióforo se llama columela. Cuando el esporangio tiene pocas esporas se denomina esporangiolo. Los merosporangios son cilíndricos, contienen pocas esporas y están reunidos sobre la columela o los extremos de las ramas del esporangióforo; si son monosporados suelen ser considerados como conidios. Los zoosporangios de los hongos acuáticos o parásitos contienen zoosporas móviles. Conidiosporangio es el zoosporangio inmaduro liberado por algunos hongos.

Teleomórficas

Gametas son las células diferenciadas que se fusionan y gametangios las estructuras que las producen. Homotálicos son los hongos que forman los gametangios de distinta polaridad en el mismo micelio. Cuando cada micelio da sólo gametangios de la misma polaridad, es necesario enfrentar dos micelios distintos del mismo hongo heterotálico para originar las esporas sexuadas. En muchos macromicetos se produce la somatogamia o fusión de células no diferenciadas que originan un micelio dicariótico, a veces con una conexión hifal a manera de puente (fíbula) entre cada célula.  Las oosporas son hipnosporas sexuadas originadas por heterogamia. La estructura femenina u oogonio produce unos elementos grandes inmóviles u oosferas que en algunos hongos se fusionan con los anterozoides (zoosporas) producidos en la estructura masculina o anteridio, y en otros se ponen en contacto con el anteridio por medio de los tubos de fertilización.  Las zigosporas son hipnosporas sexuados formados por isogamia. La hifa emite un mamelón en el que se diferencian dos partes: suspensor y gametangio. Los gametangios se fusionan originando la zigospora que suele estar rodeada por hifas protectoras nacidas de los suspensores.  Ascosporas son las esporas sexuadas internas que se originan en un número limitado (generalmente 4 u 8) dentro de una célula llamada asco. En las levaduras se fusionan los citoplasmas de dos células de polaridad distinta e inmediatamente o mucho después de la cariogamia ocurre la meiosis formándose las ascosporas dentro del asco libre. En los hongos filamentosos se producen gametangios (anteridio y ascogonio), en general morfológicamente distintos, y los núcleos pasan a través del poro formado en el punto de contacto o de un tubo receptivo llamado tricogino. En algunas especies heterotálicas los espermacios, microconidios incapaces de germinar, cumplen la función de gametas masculinas. Después de la fecundación nacen hifas ascógenas binucleadas cuyas células terminales, en forma de cayado, se convierten en ascos.

 Las hifas somáticas vecinas a los elementos sexuales suelen formar un plecténquima originando un ascoma que si está cerrado y es esférico se llama cleistotecio. Cuando tiene las hifas fértiles (himenio) estratificadas y generalmente una forma de pera, poseyendo en la madurez un poro u ostíolo por donde salen las ascosporas, se denomina peritecio. Si el plecténquima tiene forma de copa con el himenio expuesto se habla de apotecio. El ascostroma es una estructura con cavidades o lóculos que contienen ascos.

Los ascos tienen distinta forma según las especies, pueden ser sésiles o pedicelados, estar organizados en un fascículo común o nacer independientemente. Con frecuencia hay entre los ascos hifas estériles alargadas llamadas parafises. En el ostíolo suele haber hifas cortas como pelos, las perifises. Algunos ascomas tienen hifas ornamentales. La liberación de los ascos puede ser explosiva o no. En algunos ascos se abre un opérculo en el momento de liberar las esporas. Los ascos bitunicados tienen dos paredes y la externa se rompe, dejando expandirse la interna, antes de la descarga de las ascosporas.Basidiosporas son las esporas sexuadas externas que se originan en el basidio. Este es una célula hifal binucleada que sufre cambios morfológicos y se llama probasidio al estado o parte de la misma donde se produce la cariogamia. Se denomina metabasidio a la parte o estado en el cual ocurre la meiosis y forma 4 (a veces 2) tubos pequeños o esterigmas en cada uno de los cuales se forma una basidiospora. Hay dos tipos de metabasidios. El holobasidio es cilíndrico o con aspecto de clava y en algunos hongos tiene forma de tenedor.

Algunos basidiomas son como una sombrilla extendida (píleo) sostenida por un pie que a veces tiene un anillo o resto de una membrana que unía al píleo con el pie.

Otras veces hay en la base una volva o resto de un velo que envolvía a todo el basidioma joven. Hay hongos cuyos basidiomas se asemejan a un abanico, en otros son cilíndricos, esféricos o coralinos. En el basidioma cerrado el peridio envuelve a la gleba fértil y se rompe cuando las esporas están maduras.  En las royas y carbones el probasidio es una espora de pared muy gruesa llamada teliospora o teleutospora, que germina formando un tubo o metabasidio que dará origen a las basidiosporas. En el micelio uninucleado de algunas royas se forma el espermogonio o picnio que da gametas llamadas espermacios o picnosporas y lleva las hifas receptivas en la parte exterior, pero no hay autogamia. Las células binucleadas formadas como resultado de la espermatización constituyen el estrato basal del ecidio y comienzan a dividirse produciendo cadenas de ecidiosporas. Por germinación de una ecidiospora surge un micelio binucleado que origina el uredosoro con las uredosporas generalmente de largos pedicelos. Éstos al germinar dan otra vez un micelio dicariótico que puede formar nuevas uredosporas o bien teleutosporas con células binucleadas y paredes gruesas en el teliosoro o teleutosoro.  En los carbones el micelio binucleado se forma por fusión de dos células compatibles de diverso tipo y constituye un soro de teleutosporas o ustilosporas. Cada una de éstas al germinar se convierte en un metabasidio sin esterigmas que origina las basidiosporas o esporidios por brotación.